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本制品是基于荧光共振能量转移(FRET)技术，通过生物素的强竞争使淬灭剂HABA与FITC荧光染料标记的Streptavidin解离，导致在激发光(492nm)/发射光(520nm)处的荧光值升高，从而定量检测蛋白、多肽、DNA、RNA或小分子化合物等被生物素标记的水平或样品中生物素浓度的试剂盒。

HABA是一种能与链霉亲和素发生弱相互作用的染料。荧光染料标记的Streptavidin与HABA形成复合物，因为荧光共振能量转移(FRET)，Streptavidin上标记的荧光基团被淬灭(左)。与生物素和链霉亲和素的高亲和力(Kd=1×10^-15M)相比，HABA和链霉亲和素的亲和力较弱(Kd=5.8×10^-6M)，所以生物素、生物素标记的蛋白、多肽、DNA、RNA或小分子化合物等可通过强竞争置换HABA，导致Ex492nm/Em520nm的荧光值升高，荧光值与样品的生物素摩尔量成正相关(图1)，即荧光信号越强，样品的生物素化越高。

• 应用范围宽：不仅可以检测生物素标记的蛋白，也可以检测生物素标记的多肽、DNA、RNA或小分子化合物以及样品中的生物素浓度。
  
• 检测速度快：完成检测仅需约5分钟，不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选的自动化操作系统。
  
• 灵敏度高：按照每孔100μL反应体系，本试剂盒检测生物素浓度的下限为40nM(4pmol)，通常每孔仅需要50ng～1μg生物素标记的蛋白或5～100pmol生物素标记的多肽、DNA、RNA或小分子化合物，荧光法相比于显色法生物素定量检测的灵敏度提高约50倍。

• Reaction Buffer在-20℃保存后融化若有沉淀析出，可37℃水浴加热直至完全溶解。
  
• 所有试剂需完全解冻并平衡至室温后再使用，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。
  
• Biotin-BSA仅作为生物素标记的阳性对照，不提供具体的生物素标记数量。
  
• 检测时建议使用96孔黑板，推荐选购全黑96孔细胞培养板。

• Biotin标准曲线的设置
  
  • 分别取0、1、2、4、6、8、10、12、14、16μL的Biotin Standard (5μM)溶液加入96孔板中，并用Reaction Buffer补足至50μL，此时标准品Biotin浓度为0、100、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600nM。
    
  • 每孔加入50μL HABA/Streptavidin-FITC Premix，此时反应体系中的Biotin量分别为0、5、10、20、30、40、50、60、70、80pmol。
    
  • 避光，室温静置5分钟。
    
  • 使用多功能酶标仪进行荧光测定，激发光为492nm，发射光为520nm。
    
    图2.生物素标记水平检测试剂盒(荧光法)的Biotin标准曲线示意图。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
• 蛋白酶消化被生物素标记的蛋白样品(选做)
  蛋白酶消化可以使蛋白样品三级结构被破坏，内部生物素基团充分暴露，从而提高生物素定量的准确性。
  
  • 取49μL蛋白样品，如果蛋白样品浓度过高，可以用Reaction Buffer对蛋白样品进行适当稀释。
    
    • 可设置Biotin-BSA阳性对照，取25μL Biotin-BSA，加入Reaction Buffer补足至49μL。
  • 每个样品分别加入1μL Protease (0.1U/μL)，37℃消化过夜。
• 生物素或生物素标记的定量检测
  
  • 阳性对照：将5μL Biotin-BSA加入到96孔板中，用Reaction Buffer补足至50μL，或将步骤2中经50μL Protease消化过夜的Biotin-BSA样品加入96孔板中。
    
  • 将50μL样品或步骤2中经Protease消化过夜的蛋白样品加入96孔板中，如果样品不足50μL，用Reaction Buffer补足至50μL，并记录加入样品的体积为V_样品。
    
  • 各孔加入50μL HABA/Streptavidin-FITC Premix，避光，室温静置5分钟。
    
  • 使用多功能酶标仪进行荧光测定，激发光为492nm，发射光为520nm。
    
    • 为提高生物素定量的准确性，建议每个样品做3组平行检测。
    • 因蛋白酶可能会影响反应，静置时间不应超过15分钟。
• 生物素或生物素标记的定量计算
  
  • 标准曲线法(二选一)：以Biotin物质的量为X轴，多功能酶标仪读取荧光值(RFU)为Y轴，建立标准曲线(直线线性关系) (如图2所示)，拟合得到公式。
    
  • 两点法(二选一)：根据RFU_样品数值选择两个数值相近的RFU_{Biotin Standard}建立直线线性关系，拟合得到公式。例如：RFU_样品为8，与之数值相近的30pmol和40pmol Biotin Standard的RFU分别为7.59和11.44，根据这两点拟合得到公式Y=0.385X-3.96。
    
    • HABA/Streptavidin-FITC Premix本底有一定的荧光值，因此未加Biotin Standard的RFU_空白对照不为0是正常现象，并不影响后续计算。
    • RFU_样品无需减去RFU_空白对照。
    • 当检测读数在两个标准品读数之间时，使用这两个标准品采用“两点法”比“标准曲线法”的计算结果通常更为准确。
  • 将RFU_样品作为Y值代入公式，求解得到的X值即为每个孔中含有生物素(Biotin)物质的量(pmol)，同时可以计算出生物素或生物素标记的浓度。
    
  • 计算被生物素标记的蛋白、多肽、DNA、RNA或小分子化合物等的物质的量(pmol)：
    
    样品(pmol)＝样品浓度(mg/mL)

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    样品分子量(Da)×V_样品(μL)×10⁶
    
    
    
    • 样品浓度(mg/mL)指未经过任何稀释待测样品的浓度。
  • 计算生物素/蛋白、多肽、DNA、RNA或小分子化合物等的摩尔比(DOL)：
    
    DOL＝Biotin (pmol)

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    样品(pmol)
    • 计算所得数值即为每个蛋白、多肽、DNA、RNA或小分子化合物等被生物素标记的平均个数。
    
    
    
  • 计算示例：
    BSA：MW 66,430Da，concentration 0.1mg/mL，RFU_样品＝8
    根据两点法拟合得到公式Y=0.385X-3.96，8=0.385X-3.96，X=Biotin (pmol)= 31pmol
    
    样品(pmol)＝样品浓度(mg/mL)

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    样品分子量(Da)×V_样品(μL)×10⁶＝ 0.1(mg/ml)

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    66430 (mg/mmol)×5(μL)×10⁶＝7.52pmol
    
    
    DOL＝Biotin (pmol)

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    样品(pmol)＝31pmol

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    7.52pmol＝4.1生物素分子/BSA分子